انواع و روش‌های کروماتوگرافی

یکی از پرکاربردترین روش‌های جداسازی مواد در آزمایشگاه کروماتوگرافی است و در مواقعی که جداسازی به روش‌های دیگر ناممکن است به راحتی می‌توان از این روش استفاده کرد، زیرا اختلافات‌ جزئی موجود در رفتار اجسام باعث تسهیل جداسازی در جریان عبور آن‌ها از یک سیستم کروماتوگرافی می‌شود‌. این روش بسیار ساده و سریع است به طور مثال آزمایشی که ممکن است با استفاده از روش ستون تقطیر چندین روز به طول بینجامد، می‌تواند به کمک کروماتوگرافی در عرض زمانی بسیار کوتاه انجام گیرد، وسایل مورد نیاز آن نیز ارزان قیمت است  .                                                               مزیت دیگر روش‌های کروماتوگرافی این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است به این دلیل روش‌های تجزیه‌ای مربوط به جداسازی مواد کروماتوگرافی می‌توانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند.
 کروماتوگرافی لغتی یونانی به معنی رنگ نگاری است که ترکیبی از دو واژه "کروما" به معنی رنگ و "گروفین" به معنی نوشتن است. در سال 1903 برای اولین بار از این روش جداسازی مواد رنگی استفاده شد که این کار توسط میخائیل‌سوئت انجام گرفت. اما امروزه از این روش برای جداسازی مواد بی رنگ چون گازها استفاده می‌شود. اساس کروماتوگرافی ، جذب سطحی مواد و توزیع آن‌ها در دو فاز است. در این روش جداسازی بر اساس حرکت نسبی دو فاز صورت می‌گیرد بدین ترتیب که یکی از فازها که  فاز ساکن نامیده می‌شود بدون حرکت است و فاز دیگر فاز متحرک نام دارد. با عبور دادن فاز متحرک از داخل فاز ساکن جریانی به وجود می‌آید، در این حالت اجزای مختلف نمونه سرعت‌های حرکت مختلف دارند و جداسازی بر اساس همین اختلاف سرعت‌ها انجام می‌شود. فاز متحرک می‌تواند گاز یا مایع و فاز ساکن می‌تواند جامد یا مایع باشد. لازم به ذکر است که به علت انرژی جنبشی بالای مولکول‌های گازی، فاز ساکن را گاز قرار نمی‌دهند. اگر فاز ساکن جامد باشد، کروماتوگرافی جذب سطحی و اگر فاز ساکن مایع باشد کروماتوگرافی را تقسیمی می‌نامند. نوع دیگری از نام گذاری روش‌های کروماتوگرافی بر اساس ماهیت فاز متحرک و ماهیت فاز ساکن انجام می‌شود. که بدین ترتیب کروماتوگرافی به چهار بخش اصلی طبقه بندی می‌شود. نامی که در ابتدا آورده می‌شود بیان کننده ماهیت فاز متحرک و نام دوم بیان کننده ماهیت فاز ساکن است.

کروماتوگرافی مایع – جامد (LSC)
 در این روش جدا شدن بر اساس جذب سطحی یا تشکیل کمپلکس است. کروماتوگرافی LSC در واقع نوعی کروماتوموگرافی جذبی است که مواد بر اساس اختلاف در قابلیت جذب خود روی سطح جامد از یکدیگر جدا می‌شوند. این روش نیز به انواع مختلفی چون کروماتوگرافی جذب سطحی (برای جداکردن مواد شیمیایی غیر مشابه) ، کروماتوگرافی لایه نازک، کروماتوگرافی تبادل یونی و کروماتوگرافی ژلی تقسیم می‌شود.

کروماتوگرافی گاز – جامد (GSC)
 در این روش نیز اساس جداسازی جذب سطحی فاز گاز روی سطح جامد است که برای خالص سازی گازها اجسام فرار استفاده می‌شود.

کروماتوگرافی مایع – مایع (LLC)
 به دو گونه تقسیمی (برای جدا کردن مواد شیمیایی مشابه) و کاغذی استفاده می شود.

کروماتوگرافی گاز- مایع (GLC )
 کروماتوگرافی ستون مویین از این نوع است.  در LLC و GLC ، مواد بر اساس توزیع بین دو فاز جدا می‌شوند. برای انتخاب نوع روش کروماتوگرافی ابتدا روش‌های ساده‌تر مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان می شوند و اگر پاسخ گو نباشد به سراغ روش‌های پیچیده‌تر مانند روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HELC) می‌رویم.

حال به توضیح برخی روش های کروماتوگرافی می پردازیم:

کروماتوگرافی جذب سطحی
در این نوع کروماتوگرافی جداسازی بر مبنای تقاوت در جذب سطحی اجزای فاز متحرک و فاز ساکن صورت می‌گیرد. در کروماتوگرافی جذب سطحی، فاز متحرک مایع (حلالی مانند هگزان) و فاز ساکن جامد (مانند آلومین یا سیلیکاژل) است بنابراین نوع خاصی از کروماتوگرافی مایع – جامد محسوب می‌شود.
در این نوع جداسازی حلال(فاز متحرک) با عبور خود از میان ستون جامد (فاز ساکن) اجزای مخلوط را با خود حمل می‌کند. سرعت حرکت هر جزء‏ ، به میزان جذب سطحی آن بر روی ماده داخل ستون بستگی دارد. به این ترتیب سرعت ماده‌ای که کم جذب شده است بیشتر از ماده‌ای که زیاد جذب شده است خواهد بود و اجزایی که قابلیت جذب بالاتری دارند، در قسمت بالای ستون و اجسامی که قابلیت جذب کمتر دارند در قسمت‌های پایین ستون ، جذب خواهند شد. حال اگر اختلاف بین جذب‌های سطحی به حد کافی زیاد باشد، جداسازی مواد کامل انجام خواهد گرفت..

کروماتوگرافی لایه نازک(TLC)
 این نوع کروماتوگرافی نمونه ‌ای از کروماتوگرافی جذب سطحی است که در آن، به جای اینکه ستون از جاذب(فاز ساکن) پر شود، آن را به صورت لایه نازک روی یک صفحه شیشه‌ای یا لایه پلاستیکی یا ورقه فلزی قرار می‌دهند. سایر اصول جداسازی مانند روش کروماتوگرافی جذب سطحی است.

کروماتوگرافی تبادل یونی
در این روش بین فاز متحرک (محلول) و فاز ساکن (جامد)  به صورت برگشت پذیر یون مبادله می‌شود. جامد تشکیل‌دهنده فاز ساکن رزین نامیده می‌شود و پایداری مکانیکی و شیمیایی و یکنواختی اندازه ذرات از خصوصیات آن‌ها است. قالب این رزین‌ها بر پایه یک بسپار بزرگ (معمولا پلی استیرن) استوار است اما برخی از آن ها متکی بر اسید متا اکریلیک هستند، رزین‌ها به دو نوع تعویض کننده آنیونی و کاتیونی تقسیم می شوند. هر کدام از این تعویض کننده‌ها به نوع بازی ضعیف و قوی و اسیدی ضعیف و قوی تقسیم می‌شوند. می‌توان این روش را مانند کروماتوگرافی جذبی در نظر گرفت به گونه ای که رزین‌ها جایگزین جاذب شده باشند. رزین‌ها باید دارای گروه‌های مبادله کننده تک عاملی باشند و درجه اتصالات عرضی کنترل شده داشته باشند. گستره اندازه ذرات نیز باید تا آنجا که ممکن است کوچک باشد. با این روش کروماتوگرافی می‌توان محلول‌های رقیق را به خوبی جداسازی کرد.

کروماتوگرافی ژلی
این نوع کروماتوگرافی برای اولین بار در سال 1954 معرفی  و در سال 1959 اصلاح شد. در این روش جداسازی‌های مبتنی بر الک کردن مولکولی بر روی اجسام بی‌بار در جریان مهاجرت الکترو اسمزی از داخل ژل‌ها انجام می‌شود. بدین ترتیب که جداسازی بر مبنای اندازه‌های نسبی مولکول ها انجام شده و از اصطلاح صاف کردن به وسیله ژل استفاده می‌شود. ژل استفاده شده در این روش باید بی اثر و پایدار باشد. فاز ساکن از یک قالب متخلخل تشکیل شده که منفذهای آن به وسیله حلالی که فاز متحرک را تشکیل داده پر شده است. از آنجا که اساس جداسازی بر این است که مولکول‌های بزرگ تر از حد وارد سوراخ‌ها نشده و به ترتیب جرم مولکولی از ستون خارج شوند و مولکول‌های کوچک تر بر حسب شدت نفوذشان سوراخ ها را پر کنند پس اندازه سوراخ بسیار مهم است. همچنین گرانروی نمونه نیز اهمیت زیادی دارد و نباید از دو برابر گرانروی شوینده بیشتر باشد. از دیگر عوامل مهم حجم نمونه است بدین ترتیب که هر چه حجم نمونه کمتر باشد، غلظت هر جزء در محلول خارج شده نیز کمتر خواهد بود.

کروماتوگرافی تقسیمی
در این روش که نمونه‌ای از کروماتوگرافی مایع- مایع است، شیوه کار بسیار شبیه به کروماتوگرافی جذب سطحی است و تفاوت این دو روش در ماهیت ماده پر شده در ستون است. همچنین حجم ظرفیت یک ستون تقسیمی، غالبا کوچک تر از ظرفیت یک ستون جذب سطحی بوده و گاهی این اختلاف خیلی زیاد است. فاز ثابت لایه ای از محلول است که روی سطح جامد ناصافی مانند سیلیکاژل قرار دارد و فاز متحرک مایعی غیر محلول در مایع اولی است. سرعت حرکت یک جزء از مخلوط تابع انحلال پذیری آن در فاز ساکن است یعنی جدا شدن اجزا بدین صورت است که اجسامی که بیشتر حل می‌شوند، کندتر از اجسامی که کمتر حل می‌شوند به طرف پایین ستون حرکت می‌کنند. در جریان عبور از ستون ، اجسام میان دو فاز تقسیم شده و جداسازی انجام می‌شود. در این روش ابتدا مخلوط اجسام به صورت یک نوار در ستون در می‌آید که علت آن جذب سطحی یا جذب به وسیله فاز ساکن است.

کروماتوگرافی کاغذی
کروماتوگرافی کاغذی نوع خاصی از کروماتوگرافی تقسیمی است که در آن صفحات کاغذی جای ستون پر شده را می‌گیرند. در این روش فاز ساکن کاغذ است. مولکول‌های سلولز نیز به نوبه خود به وسیله ساختار الیافی کاغذ در وضعیت‌های ثابت نگه داشته می‌شود. در ابتدا کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی مخلوط‌های مواد آلی به کار می رفت. اما امروزه برای جداسازی یون‌‌های معدنی استفاده می‌شود. به وسیله این روش هم آنیون‌ها و هم کاتیون‌ها را می‌توان جداسازی کرد.
برای انجام این روش قطره‌ای از محلول حاوی مخلوطی که باید جدا شود را روی یک صفحه یا نوار کاغذ صافی در محل علامت گذاری شده قرار می‌دهند. قطره به صورت یک لکه حلقوی در این محل پخش می‌شود. هنگامی که لکه خشک شده کاغذ را در یک ظرف مناسب سربسته طوری قرار می‌دهند که یک سر آن در حلال انتخاب شده به عنوان فاز متحرک فرو رود، حلال از طریق الیاف کاغذ در نتیجه عمل موئینگی نفوذ می‌کند. پس از گذشت زمان از قبل تعیین شده، وقتی حلال مسافت مناسبی را طی کرد، کاغذ را بیرون آورده و حلال را با علامتی مشخص می‌کنند. پس از خشک شدن صفحه وقتی محل های مناطق جدا شده آشکار شدند هر یک از اجسام به طور جداگانه شناسایی می‌شوند. در موارد ایده‌آل ، هر جسم با واکنش گر مکان یاب ، رنگ مخصوصی می‌دهد که در مورد مواد معدنی بیشتر و درمورد مواد آلی کمتر مشاهده می‌شود. ساده‌ترین روش شناسایی بر اساس مقدار Rf یعنی نسبت فاصله طی شده به وسیله جبهه حلال است.
از نقایص کروماتوگرافی کاغذی می‌توان به مواردی چون لکه‌های چند تایی ، دنباله دار شدن  و اثرات لبه یا کناره اشاره کرد. این روش در جداسازی‌ مواد با ماهیت زیستی وسیع ترین کاربرد را داشته و در مسائل کلینیکی و زیست شیمیایی ، جداسازی اسیدهای آمینه و پپتیدها در بررسی ساختارهای پروتئین به کار گرفته می‌شود. آزمایش روزمره ادرار و سایر مایعات بدن برای اسید آمینه و قند، جداسازی بازهای پورین و نوکلئوتیدها در آزمایش اسیدهای نوکلئیک، جداسازی استرئیدها، تجزیه عمومی، تجزیه بسپارها، تشخیص و ارزیابی فلزات در خاک‌ها و نمونه های زمین شناسی، بررسی ترکیبات فنلی در عصاره های گیاهی، جداسازی آلکالوئیدها و جداسازی ترکیبات علامت‌دار به وسیله رادیو ایزوتوپ‌ها از دیگر کاربردهای کروماتوگرافی کاغذی است، البته توجه داشته باشید که برای جداسازی مواد فرار غیر فعال مانند هیدروکربن‌ها و دیگری جداسازی اسیدهای چرب با فراریت بیشتر  این روش مناسب نیست.

کروماتوگرافی ستونی

در کروماتوگرافی ستونی جسم بین فازهاى مایع و جامد پخش میشود. فاز ساکن جسم جامدی است و این جسم اجزای مایعی را که از آن میگذرد به طور انتخابی در سطح خود جذب میکند و آنها را جدا میکند. اثرهایی که باعث جذب سطحی میشوند همان اثرهایی هستند که موجب جذب در مولکولها میشوند. این اثرها عبارتند از: جاذبه الکترواستاتیکی، ایجاد کمپلکس، پیوند هیدروژنی، نیروی واندروالس و غیره. برای جدا کردن یک مخلوط با کروماتوگرافی ستونی، ستون را با جسم جامد فعالی (فاز ساکن) مانند آلومینا یا سیلیکاژل پر میکنند و کمی از نمونه مایع را روی آن میگذارند. نمونه ابتدا در بالای ستون جذب میشود. سپس حلال استخراج کننده ای را در داخل ستون جریان میدهند. این فاز مایع متحرک، اجزای مخلوط را با خود میبرد. ولی به علت نیروی جاذبه انتخابی فاز جامد، اجزای مربوط میتوانند با سرعتهای مختلفی به طرف پایین ستون حرکت کنند. ترکیبی که با نیروی کمتری جذب فاز ساکن شود سریعتر خارج میشود زیرا که درصد مولکولی آن در فاز متحرک از ترکیبی که با نیروی زیادتری جذب فاز ساکن میشود بیشتر است.

اجزای تفکیک شده را میتوان مجددا به دو روش به دست آورد:

1) مواد جامد ستون را میتوان خارج کرد و قسمتی از آنرا که حاوی باند مورد نظر است برید و با حلال مناسب استخراج کرد.

2) چون باندها با زمانهای مختلفی خارج میشوند میتوان آنقدر حلال را از ستون عبور داد تا باندها از انتهای آن خارج شوند و در ظرف جداگانه ای بریزند.

معمولا روش دوم کاربرد بیشتری دارد.

در مورد اجسام رنگین میتوان باندهایی را که به طرف پایین ستون می آیند مستقیما مشاهده کرد. اما در مورد اجسام بیرنگ نمیتوان تغییرات را مستقیما مشاهده کرد. با این حال بسیاری از اجسام در هنگام تابش نور ماورای بنفش فلوئورسانس پیدا میکنند و در چنین مواردی از این خاصیت جهت مشاهده باندها استفاده میشود. معمولا برای پی بردن به جریان عمل کروماتوگرافی ستونی حجمهای کوچک و ثابتی (مثلا 25 میلی لیتر) از محلول استخراج شده را جمع آوری میکنند. سپس حلال آنها را تبخیر میکنند تا ببینند جسمی در آنها وجود دارد یا خیر. گرچه ممکن است یک جسم در چند ظرف پخش شود، ولی اگر حجم هر جزء نسبتا کم گرفته شود (مثلا کمتر از 10% حجم ستون) معمولا باندهای مختلف در ظروف مختلف جمع آوری میشوند. روش دیگری که برای پی بردن به وضع تفکیک مناسب است آن است که محلول استخراج شده در فاصله زمانی مختلف با کروماتوگرافی لایه نازک مورد بررسی قرار گیرد.

تعدادی از جاذبهای جامدی که عموما مصرف میشوند عبارتند از: آلومینا، سیلیکاژل، فلورسین، زغال چوب، منیزیم اکسید، کلسیم کربنات، نشاسته و شکر. معمولا شیمیدانهای آلی از آلومینا، سیلیکاژل و فلورسین بیشتر استفاده میکنند.

آلومینا (Al₂O₃) ترکیب قطبی بسیار فعالی است که قدرت جذب زیادی دارد و به سه صورت موجود است: خنثی، شسته شده با اسید و شسته شده با باز. آلومینای بازی برای ترکیبهای اسیدی و آلومینای اسیدی برای ترکیبهای بازی قدرت تفکیک خوبی نشان میدهد. در ترکیبهایی که به شرایط اسیدی و بازی حساسیت دارند و واکنش شیمیایی دارند باید از آلومینای خنثی استفاده کرد. آلومینا با قطبیت زیادی که دارد ترکیبهای قطبی را به شدت جذب میکند و در نتیجه ممکن است استخراج آنها از ستون را مشکل کند. فعالیت (قدرت جذب) آلومینا را میتوان با افزایش کمی آب کاهش داد، درجه فعالیت آلومینا با درصد وزنی آب موجود مشخص میشود. سیلیکاژل و فلورسین هم قطبی هستند ولی قطبیت آنها از آلومینا کمتر است.

برای اینکه جاذبهای جامد نیروی موثر تری داشته باشند، باید اندازه ذرات آنها یکنواخت و سطح مخصوص آنها زیاد باشد. چنین سطحی باعث تسریع تعادل جسم در دو فاز میشود. این حالت در ایجاد باندهای باریک اهمیت دارد.

در تعیین شرایط یک تجربه کروماتوگرافی باید به ماهیت فاز مایع (حلال) مصرفی توجه کرد. حلال نیز میتواند در جسم جامد جذب شود و به این وسیله برای جذب مواضع جذبی که در سطح جامد وجود دارند، با جسم حل شده رقابت کند. چنانچه حلال قطبی تر باشد و شدیدتر از اجزای مخلوط جذب شود، تقریبا تمام اجزاء در فاز مایع متحرک باقی میمانند و تفکیکی که در ضمن تجربه صورت میگیرد ناچیز خواهد بود. در نتیجه برای این که تفکیک خوب انجام شود باید قطبیت حلال استخراجی به طور قابل ملاحظه ای کمتر از اجزای مخلوط باشد. به علاوه باید اجزای مخلوط در حلال حل شوند، زیرا در غیر این صورت اجزا به طور دایم در فاز ساکن ستون جذب میشوند و در آن باقی میمانند. قدرت استخراجی حلالهای مختلف (یعنی توانایی آنها در انتقال یک جسم معین به پایین ستون) بترتیب زیر از بالا به پایین زیاد میشود:  

هگزان>کربن تتراکلرید>تولوئن>بنزن>دی کلرومتان>کلروفرم>اتیل اتر>اتیل استات>استون>پروپانول >اتانول>متانول>آب

در یک کروماتوگرافی ستونی ساده نمونه را در بالای ستون میگذارند و در طول تفکیک از حلال واحدی استفاده میکنند. بهترین حلال انتخابی، حلالی است که بیشترین فاصله را در باندها ایجاد کند. چون احتمالا بهترین حلال در اثر تجربه بدست می آید، گاهی راحتتر است که در انتخاب حلال برای کروماتوگرافی ستونی از روش کروماتوگرافی لایه نازک استفاده شود. تعداد زیادی از تجربه های کروماتوگرافی لایه نازک را میتوان با استفاده از حلالهای مختلف، در زمان نسبتا کوتاهی انجام داد. معمولا بهترین حلال یا مخلوط حلالی که به این روش به دست می آید برای کروماتوگرافی ستونی مناسب است. معمولا از روشی که به استخراج تدریجی (یا جزء به جزء) معروف است استفاده میشود. در این روش برای ظهور کروماتوگرام از یک سری حلالهایی استفاده میکنند که قطبیت آنها مرتبا رو به افزایش میرود. در شروع با یک حلال غیر قطبی (معمولا هگزان) ممکن است یک باند به طرف پایین ستون حرکت کند و از آن خارج شود و در این حال باندهای دیگر در نزدیکی ابتدای ستون باقی بمانند. سپس حلالی که قطبیت آن اندکی بیشتر است به کار میبرند. در حالت ایده آل باید یک باند خارج شود و در این حال بقیه باندها در عقب آن باقی بمانند. چنانچه قطبیت حلال یکباره زیاد بالا رود، ممکن است تمام باندهایی که باقی مانده اند یکباره از ستون خارج شوند. بنابر این باید در هر مرحله قطبیت حلال به مقدار کم و با قاعده معینی افزایش یابد. بهترین راه انجام این کار آن است که از حلالهای مخلوط استفاده شود و تعویض کامل حلال چندان مناسب نسیت. طریقه پر کردن ستون بسیار اهمیت دارد زیرا ستونی که خوب پر نشود اجزاء را هم خوب تفکیک نمیکند. جسم پرشده باید همگن باشد و در آن هوای محبوس یا حباب بخار وجود نداشته باشد.

کروماتوگرافی ستون مویین
در این روش که نوعی از کروماتوگرافی گاز- مایع محسوب می شود، لوله مویین بلندی وجود دارد که لایه نازکی از فاز ساکن داخل آن را پوشانده است. قدرت جداسازی ستون‌های مویین پنج برابر ستون‌های معمولی است و زمان جداسازی مواد در این روش کمتر است. همچنین از یک آشکارساز کوچک و حساس و یک تقسیم کننده خطی تشکیل شده تا عواملی چون تغییرات دما، سرعت عبور، اندازه نمونه و نسبت تقسیم تاثیری بر آن نداشته باشد. از آنجا که سرعت خارج شدن اجزای جدا شده بسیار بالا است، آشکارساز باید زمان پاسخ سریعی داشته باشد. البته ثبات‌های معمولی پتانسیل سنجی قادر به همگامی با علائم حاصل از آشکارساز نبوده و باید از دستگاه دیگری مانند یک نوسان کننده اشعه کاتد برای نمایش علائم می‌توان استفاده کرد.

http://www.iranbmemag.com/fa/issue/page.asp?eid=116&id=931&cid=1947

http://www.khschool.ir/

چند نکته :

اثرهایی که باعث جذب سطحی میشوند همان اثرهایی هستند که موجب جذب در مولکولها میشوند. این اثرها عبارتند از: جاذبه الکترواستاتیکی، ایجاد کمپلکس، پیوند هیدروژنی، نیروی واندروالس و غیره. اما در مورد اجسام بیرنگ نمیتوان تغییرات را مستقیما مشاهده کرد. با این حال بسیاری از اجسام در هنگام تابش نور ماورای بنفش فلوئورسانس پیدا میکنند و در چنین مواردی از این خاصیت جهت مشاهده باندها استفاده میشود. تعدادی از جاذبهای جامدی که عموما مصرف میشوند عبارتند از: آلومینا، سیلیکاژل، فلورسین، زغال چوب، منیزیم اکسید، کلسیم کربنات، نشاسته و شکر. معمولا شیمیدانهای آلی از آلومینا، سیلیکاژل و فلورسین بیشتر استفاده میکنند. در کروماتو گرافی لایه نازک حلال به دلیل وجود فشار اسمزی (osmotic pressure) شروع به بالارفتن می کند. در کروماتو گرافی کاغذی حلال از طریق الیاف کاغذ در نتیجه عمل موئینگی نفوذ می‌کند.